3/1 :20246
2.2.46. ХРОМАТОГРАФИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ РАЗДЕЛЕНИЯ
ВВЕДЕНИЕ
Хроматографические методы разделения представляют собой многостадийные методы
разделения, при которых компоненты образца распределяются между двумя фазами, одна из
которых является неподвижной, а другая - подвижной. Неподвижная фаза может быть твердой
или жидкой, нанесенной на твердое вещество или гель. Неподвижная фаза может помещаться в
колонку, наноситься в виде слоя или распределяться в виде пленки и т. д. Подвижная фаза
может быть газообразной или жидкой. Разделение может быть основано на адсорбции,
массовом распределении (разделении), ионном обмене и т. д., или на различиях в физико-
химических свойствах молекул, таких, как размер, масса, объем и т.д. Данный раздел содержит
определения и расчеты общих параметров и общеприменимых требований к пригодности
системы. Принципы разделения, описание приборов и методик приводятся в следующих общих
монографиях:
– Бумажная хроматография (2.2.26);
– Тонкослойная хроматография (2.2.27);
– Газовая хроматография (2.2.28);
– Жидкостная хроматография (2.2.29);
– Эксклюзионная хроматография (2.2.30).
ОПРЕДЕЛЕНИЯ
Пригодность хроматографичекой системы и критерии приемлемости, указанные в
монографиях, установлены с использованием параметров, определение которых приведены
ниже. При применении определенного оборудования ряд параметров, например, отношение
сигнал/шум и разрешение, может рассчитываться с помощью программного обеспечения,
предоставляемого производителем прибора. Обеспечение соответствия способов расчета,
используемых в программном обеспечении, требованиям Фармакопеи и внесение любых
необходимых поправок в случае их несоответствия входит в ответственность пользователя.
Хроматограмма
Хроматограмма – графическое или иное представление зависимости сигнала детектора,
концентрации веществ в элюате или другой количественной величины, используемой для
измерения концентрации веществ в элюате от времени или объема. В идеале хроматограммы
представляют собой последовательность гауссовых пиков, расположенных на базовой линии
(рисунок 2.2.46.-1).
Рисунок 2.2.46.-1.
где:
V
M
– мертвый объем;
t
M
– мертвое время;
V
R1
– объем удерживания пика 1;
t
R1
– время удерживания пика 1;
V
R2
– объем удерживания пика 2;
t
R2
– время удерживания пика 2;
W
h
– ширина пика на половине высоты;
Wi – ширина пика в точке перегиба;
h – высота пика;
h/2 – половина высоты пика.
Константа распределения (К
0
)
В эксклюзионной хроматографии характеристики элюирования компонента из определенной
колонки могут описываться константой распределения (называемой также коэффициентом
распределения), которую рассчитывают по формуле:
где:
t
R
– время удерживания;
t
0
– время удерживания неудерживаемого компонента;
t
t
– общее время подвижной фазы.
Объем задержки (D) (называемый также VD)
Объем задержки (известный также как объем задержки градиента) представляет собой объем
между точкой, при которой происходит смешивание элюентов, и входом в колонку. Объем
задержки может быть определен в приведенных ниже условиях хроматографирования.
Колонка: хроматографическую колонку заменяют подходящей капиллярной трубкой (например,
длиной 1 м и внутренним диаметром 0.12 мм).
Подвижная фаза:
– подвижная фаза А: вода для хроматографии Р;
– подвижная фаза В: 0.1 % (об/об) раствор ацетона Р в воде для хроматографии Р;
Время
Подвижная фаза А
Подвижная фаза В
(мин)
(%, об/об)
(%, об/об)
0‒20
100 → 0
0 → 100
20‒30
0
100
– скорость подвижной фазы: устанавливают до достаточного обратного давления (например,
2 мл/мин);
– детектирование: спектрофотометр при длине волны 265 нм.
Определяют время (t
0.5
) в минутах, при котором поглощение/оптическая плотность
увеличивается на 50 % (рисунок 2.2.46.- 2).
где:
t
D
– t
0.5
– 0.5 t
G
,
в минутах;
t
G
– предварительно установленное время градиента (равное 20 мин);
F – скорость подвижной фазы, в миллилитрах в минуту.
Рисунок 2.2.46.-2.
Примечание: в случае применимости, данное измерение выполняется с помощью автосамплера
в положении «впрыск», чтобы включить объем инжекционной петли в объем задержки.
Мертвое время (t
M
)
Мертвое время (t
M
) – время, необходимое для элюирования неудерживаемого компонента
(рисунок 2.2.46.-1, шкала базовой линии в минутах или секундах). В эксклюзионной
хроматографии используют символ «t
0
» (время удерживания неудерживаемого компонента).
Мертвый объем (V
M
)
Мертвый объем (V
M
) – объем подвижной фазы, необходимый для элюирования
неудерживаемого компонента. «Мертвый объем» может быть рассчитан по «мертвому»
времени (t
M
) и скорости подвижной фазы (F) в миллилитрах в минуту по формуле:
В эксклюзионной хроматографии используют символ «V
0
» (объем удерживания
неудерживаемого компонента).
Пик
Пик – участок хроматограммы записанный сигналом детектора, при элюировании из колонки
одного компонента (или двух более неразделенных компонентов). Пик может быть
охарактеризован площадью пика или высотой пика (h).
Отношение пик/впадина (p/v)
Отношение пик/впадина может использоваться в качестве критерия пригодности
хроматографической системы, когда разделение до базовой линии между двумя пиками не
достигнуто (рисунок 2.2.46.-3).
где:
H
p
– высота меньшего пика относительно экстраполированной базовой линии;
H
v
– высота над экстраполированной базовой линией наиболее низкой точки кривой,
разделяющей меньший и больший пики.
Рисунок 2.2.46.-3.
Высота тарелки (H) (высота, эквивалентная одной теоретической тарелке
Отношение длины колонки (L) в микрометрах к числу тарелок (N).
Число тарелок (N) (число теоретических тарелок)
Число теоретических тарелок (N) – число, указывающее эффективность (кажущейся
эффективности) колонки. Число теоретических тарелок может быть рассчитано по данным,
полученным в зависимости от методики как при изотермическом, или изократическом
режимах, так и режиме постоянной плотности по формуле, в которой величины t
R
и w
h
должны
быть выражены в одинаковых единицах:
где:
t
R
– время удерживания пика компонента;
W
h
– ширина пика на половине высоты (h/2).
Число теоретических тарелок зависит от компонента, используемой колонки, температуры
колонки, подвижной фазы и времени удерживания.
Уменьшенная высота тарелки (h)
Уменьшенная высота тарелки (h) – отношение высоты тарелки (Н) в микрометрах к диаметру
частиц (d
p
) в микрометрах.
Относительное замедление (R
rel
)
Относительное замедление, используемое в плосткостной хроматографии, рассчитывают как
отношение расстояний, пройденных пятном испытуемого и стандартного образцов (рисунок
2.2.46.-4).
где:
a – расстояние, пройденное подвижной фазой;
b – расстояние, пройденное испытуемым образцом;
c – расстояние, пройденное стандартным образцом.
Рисунок 2.2.46.- 4.
Относительное удерживание (r)
Относительное удержание рассчитывают по формуле:
где:
t
R1
– время удерживания пика определяемого компонента;
t
Rst
– время удерживания пика сравнения (обычно пик, испытуемого вещества);
t
M
– мертвое время.
Неоткорректированное относительное удерживание (r
G
)
Неоткорректированное относительное удерживание рассчитывают по формуле:
При отсутствии других указаний, значения относительного удерживания, указанные в
монографиях, соответствуют нескорректированному относительному удерживанию. В
плосткостной хроматографии вместо t
Rst
и t
Ri
используют коэффициенты замедления R
Fst
и R
Fi
.
R
Fst
(известный также как R
st
) определяют по отношению расстояния, пройденного веществом,
используемым в качестве стандарта.
Разрешение (R
s
)
Разрешение между пиками двух компонентов (рисунок 2.2.46.-1) рассчитывают по формуле:
где:
t
R2
> t
R1
t
R1
, t
R2
– времена удерживания пиков;
w
h1
, w
h2
– ширина пиков на половине высоты.
В количественной плосткостной хроматографии с использованием денситометрии вместо
времен удерживания используют пройденные расстояния, и разрешение между пиками двух
компонентов рассчитывают по формуле:
где:
R
F2
> R
F1
R
F1
, R
F2
– коэффициенты замедления пиков;
w
h1
,w
h2
– ширина пиков на половине высоты;
a – расстояние, пройденное фронтом растворителя.
Коэффициент замедления (R
F
)
Коэффициент замедления (известный также как коэффициент удерживания (R
F
), используемый
в плосткостной хроматографии, представляет собой отношение расстояния от точки нанесения
пробы до центра пятна и расстояния, пройденного фронтом растворителя от точки нанесения
пробы (рис. 2.2.46.-4).
где:
b – расстояние, пройденное испытуемым образцом;
а – расстояние, пройденное фронтом растворителя.
Коэффициент удерживания (k)
Коэффициент удерживания (известный также как коэффициент распределения масс (D
m
) или
коэффициент емкости (k′)) определяют по формуле:
где:
K
С
– константа распределения (известная также как коэффициент равновесного
распределения);
V
S
– объем неподвижной фазы;
V
M
– объем подвижной фазы.
Коэффициент удерживания компонента может быть определен из хроматограммы по формуле:
где:
t
R
– время удерживания;
t
м
– мертвое время.
Время удерживания (t
R
)
Время удерживания (t
R
) – время, прошедшее между введением образца и появлением
максимального отклика пика элюированной зоны образца (рисунок 2.2.46-1, шкала базовой
линии в минутах или секундах).
Объем удерживания (V
R
)
Объем удерживания (V
R
) – объем подвижной фазы, необходимый для элюирования компонента.
Объем удерживания может быть рассчитан по времени удерживания (t
R
) и скорости подвижной
фазы (F) в миллилитрах в минуту по формуле:
Время удерживания неудерживаемого компонента (t
0
)
В эксклюзионной хроматографии время удерживания компонента, молекулы которого больше,
чем наибольшие поры геля (рисунок 2.2.46.-5).
Рисунок 2.2.46.-5.
Объем удерживания неудерживаемого компонента (V
0
)
В эксклюзионной хроматографии объем удерживания компонента, молекулы которого больше,
чем наибольшие поры геля. Объем удерживания неудерживаемого компонента может быть
рассчитан по времени удерживания неудерживаемого компонента (t
0
) и скорости подвижной
фазы (F) в миллилитрах в минуту по формуле:
Коэффициент разделения (α)
Относительное удерживание рассчитывают для двух соседних пиков (по условию, значение
коэффициента разделения всегда > 1) по формуле:
где:
k
1
– коэффициент удерживания пика 1;
k
2
– коэффициент удерживания пика 2.
Отношение сигнал/шум (S/N)
Кратковременный шум оказывает влияние на прецизионность и правильность количественного
определения. Отношение сигнал/шум рассчитывают по формуле:
где:
H – высота пика (рисунок 2.2.46.-6) соответствующая рассматриваемому компоненту на
хроматограмме, раствора сравнения; высоту измеряют от максимума пика до
экстраполированной базовой линии сигнала, наблюдаемого на расстоянии, равном
двадцатикратной ширине на половине его высоты;
h – область фонового шума на хроматограмме, полученной при введении контрольного
раствора (рисунок 2.2.46.-7) наблюдаемая на расстоянии, равном двадцатикратной
ширине на половине высоты пика на хроматограмме, раствора сравнения, и, по
возможности, расположенная по обе равные стороны от места возможного
обнаружения пика.
Рисунок 2.2.46.-6. – Хроматограмма раствора сравнения
Рисунок 2.2.46.-7. – Хроматограмма контрольного раствора
Если базовая линия при двадцатикратной ширине пика на половине высоты пика не получается
из-за пиков растворителей и реактивов, а также пиков подвижной фазы или матрицы
испытуемого образца, из-за температурной программы газовой хроматографии, тогда
допускается применение базовой линии равной не менее пятикратной ширины пика на
половине высоты пика.
Коэффициент симметрии (A
s
)
Коэффициент симметрии пика (известный также как коэффициент асимметрии или фактор
хвоста) (рисунок 2.2.46.-8) рассчитывают по формуле:
где:
w
0.05
– ширина пика на одной двадцатой его высоты;
d – расстояние между перпендикуляром, опущенным из максимума пика, и передней
границей пика на одной двадцатой его высоты.
Значение A
s
, равное 1.0, означает полную симметрию. Если A
s
> 1.0, пик имеет растянутый
задний фронт («хвост»); если A
s
< 1.0, пик имеет растянутый передний фронт.
Рисунок 2.2.46.-8.
Повторяемость системы
Повторяемость системы выражают в виде рассчитанного относительного стандартного
отклонения в процентах (% RSD) последовательных серий измерений для не менее трех
введений или нанесений раствора сравнения и рассчитывают по формуле:
где:
y
i
‒ индивидуальные значения пика, высоты пика или отношения площадей в методе
внутреннего стандарта;
ȳ ‒ среднее индивидуальных значений;
n ‒ число индивидуальных значений.
Общее время подвижной фазы (t
t
)
В эксклюзионной хроматографии время удерживания компонента, молекулы которого меньше,
чем наименьшие поры геля (рисунок 2.2.46.-5).
Общий объем подвижной фазы (V
t
)
В эксклюзионной хроматографии объем удерживания компонента, молекулы которого меньше,
чем наименьшие поры геля. Общий объем подвижной фазы может быть рассчитан по общему
времени подвижной фазы (t
t
) и скорости подвижной фазы (F) в миллилитрах в минуту по
формуле:
ПРИГОДНОСТЬ СИСТЕМЫ
В данном разделе рассматривается только жидкостная хроматография и газовая хроматография.
Различные части применяемого оборудования должны быть квалифицированы и способны
достижению уровня функционирования, необходимого для проведения испытания или
количественного определения.
Испытания пригодности системы являются неотъемлемой частью методики и используются для
обеспечения надлежащего функционирования хроматографической системы. Для оценки
производительности хроматографической системы используют следующие параметры: число
тарелок колонки, коэффициент удерживания (коэффициент распределения масс),
повторяемость системы, отношение сигнал/шум, разрешение, отношение пик/впадина и
коэффициент симметрии. В случае сложных хроматографических профилей (например, для
биотехно-логических/биологических лекарственных средств), как указано в частной
монографии, в качестве проверки пригодности может использоваться визуальное сравнение
профилей. На хроматографическое поведение могут влиять следующие факторы:
– состав и температура подвижной фазы;
– ионная сила и рН водного компонента подвижной фазы;
– скорость подвижной фазы, размеры колонки, температура и давление колонки;
– характеристика неподвижной фазы, в том числе тип хроматографического носителя
(состоящий из частиц или монолитный), размер частиц или пор, пористость, удельная
площадь поверхности;
– обращенно-фазовая и другие модификации поверхности неподвижной фазы, степень
химической модификации (блокирование концевых групп, т.е. эндкепирование, содержание
углерода и т. д.).
При отсутствии других указаний в монографии, времена удерживания и относительное
удерживание, указанные в монографиях, приводятся для информации. К относительным
удержаниям не применяются критерии приемлемости. Соответствие требованиям пригодности
системы должно поддерживаться в течение всего процесса хроматографирования. Испытание
проб не допускается при не подтверждении пригодности системы. Данные требования должны
выполняться в дополнение к любым другим критериям пригодности системы, указанным в
частной монографии. Если в монографии указаны особые требования, тогда они заменяют
требования, приведенные в данном разделе.
Повторяемость системы – количественное определение активной фармацевтической
субстанции или вспомогательных веществ
При количественном определении активной фармацевтической субстанции или
вспомогательного вещества, при значении 100 % для чистого вещества и при отсутствии
требований к повторяемости системы, максимально допустимое относительное стандартное
отклонение (% RSD) для заданных пределов рассчитывают из серии введений раствора
сравнения (n = 3‒6).
Максимально допустимое относительное стандартное отклонение отклика не должно
превышать соответствующего значения, приведенного в таблице. 2.2.46.-1.
где:
К – константа (0.349), полученная из уравнения , в котором
соответствуют значению относительного стандартного отклонения, в процентах,
при шести повторных вводах пробы для B = 1.0;
В – верхний предел количественного содержания, указанный в частной монографии, за
вычетом 100 %;
n – число повторных введений раствора сравнения (3 ≤ n ≤ 6);
t
90%
,
n-1
– коэффициент Стьюдента t при доверительной вероятности 90 % двустороннем
интервале с числом степеней свободы n -1.
Таблица 2.2.46.-1. ‒ Максимально допустимое относительное стандартное отклонение
(количественное определение)
Количество отдельных вводов n
3
4
5
6
В (%)
Максимально допустимое относительное стандартное отклонение (%)
2.0
0.41
0.59
0.73
0.85
2.5
0.52
0.74
0.92
1.06
3.0
0.62
0.89
1.10
1.27
Чувствительность системы
Отношение сигнал/шум используется для определения чувствительности системы. Предел
количественного определения (соответствующий отношению сигнал/шум, равному 10) равен
или меньше порога информирования.
Для определения отношения сигнал/шум вводят раствор испытуемого образца в концентрации,
соответствующей порогу информирования (например, 0.05 %). В качестве альтернативы
используют раствор сравнения, используемый для количественного определения неуказанных
примесей (например, 0.10 % концентрация испытуемого раствора), и экстраполируют площадь
основного пика до порога информирования (например, половина площади пика, полученная с
раствором сравнения при 0.10 %).
Симметрия пика
При отсутствии других указаний, при испытаниях или количественном определении
коэффициент симметрии (фактор хвоста) пика, используемый для расчета количественного
содержания, должен составлять от 0.8 до 1.8.
КОРРЕКТИРОВАНИЕ УСЛОВИЙ ХРОМАТОГРАФИРОВАНИЯ
Описанные условия хроматографирования должны быть валидированы при разработке частной
монографии. Ниже приведены пределы, в которых могут корректироваться различные
параметры хроматографических испытаний без существенного изменения фармакопейных
аналитических методик. Изменения, отличные от указанных, требуют ревалидации методики.
Многочисленные корректирования могут оказать негативное влияние на производительность
хроматографической системы и должны быть правильно оценены пользователями. Это
особенно важно в тех случаях, когда схема разделения описывается как профиль. В таких
случаях необходимо провести оценку рисков.
Любые вносимые изменения должны быть в соответствии с фармакопейной методикой. Если в
фармакопейную методику вносятся изменения, тогда требуется верификация методики. Чтобы
проверить пригодность скорректированной фармакопейной методики, необходимо оценить
соответствующие аналитические параметры, на которые может повлиять изменение. Если
фармакопейная аналитическая методика была скорректирована в соответствии с требованиями,
изложенными ниже, дальнейшие корректировки не допускаются без соответствующей
ревалидации. Подтверждение соответствия критериев пригодности системы необходимо для
надлежащего проведения испытания или количественного определения.
Корректирование условий хроматографирования с градиентном элюированием или
программированием температуры являются более критичной, чем с изократическом или
изотермическом элюировании, так как может вызвать сдвиг пиков на различных уровнях
градиента или на другие температуры элюирования, потенциально вызывая частичное или
полное совместное элюирование соседних пиков или инверсию пиков и, таким образом,
привести к некорректному установлению пиков, маскированию пиков, или к такому их
смещению, при котором элюирование будет происходить за пределами указанного времени
элюирования. Для обеспечения пригодности системы корректирование некоторых параметров
четко указывают в частной монографии.
ТОНКОСЛОЙНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ
Состав подвижной фазы: содержание компонента растворителя, присутствующего в меньшем
количестве, может корректироваться в пределах ± 30 % (относительное содержание) или ± 2 %
(абсолютное содержание), в зависимости от того, что больше; абсолютное содержание других
компонентов не может быть изменено более чем на10 %. Компонент, присутствующий в
меньшем количестве, составляет менее или равен (100/n) %, где n - общее количество
компонентов подвижной фазы. Для меньшего по содержанию компонента, составляющего 10 %
подвижной фазы, корректирование относительного содержания на 30 % допускает предельные
значения от 7 % до 13 %, а корректирование абсолютного содержания на 2 % допускает
предельные значения от 8 % до 12 %, т.е. корректирование по относительному содержанию
больше; для меньшего по содержанию компонента, составляющего 5 % подвижной фазы,
корректирование относительного содержания на 30 % допускает предельные значения от 3.5 %
до 6.5 %, а корректирование абсолютного содержания на 2 % допускает предельные значения
от 3 % до 7 %, т.е. в данном случае корректирование по абсолютному содержанию больше.
рН водного компонента подвижной фазы: ± 0.2 рН, при отсутствии других указаний в частной
монографии.
Концентрация солей в буферном компоненте подвижной фазы: ± 10 %.
Наносимый объем пробы: от 10 % до 20 % от указанного объема при использовании пластин с
малом размером частиц (от 2 мкм до 10 мкм).
ЖИДКОСТНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ: ИЗОКРАТИЧЕСКОЕ ЭЛЮИРОВАНИЕ
Параметры колонки и скорость подвижной фазы
Неподвижная фаза: не допускается изменение заместителей (т.е. не допускается замена C18 на
C8); должны быть одинаковыми другие физико-химические характеристики неподвижной фазы
(т.е. хроматографическая основа, модификация поверхности и степень химической
модификации); допускается замена колонок с полностью пористыми частицами на колонки с
поверхностно-пористыми частицами при соблюдении условий вышеуказанных требований.
Размеры колонки (размер частиц, длина): размер частиц и/или длина колонки могут быть
изменены при условии, что отношение длины колонки (L) к размеру частиц (dp) остается
постоянным или находится в диапазоне от – 25 % до + 50 % от указанного соотношения L/dp.
Для изменения размера частиц, т.е. полностью пористые на поверхностно-пористые, могут
быть использованы другие комбинации L и dp при условии, что число тарелок (N) находится в
пределах от – 25 % до + 50 % относительно указанной колонки. Данные изменения
допускаются при выполнении требований пригодности системы и при подтверждении
селективности и эквивалентности порядка элюирования контролируемых примесей.
Размеры колонки (внутренний диаметр): внутренний диаметр колонки может корректироваться
при отсутствии изменения размера частиц и/или длины колонки. Необходимо соблюдать
осторожность, если в результате корректировки уменьшается объем пика из-за меньшего
размера частиц или меньшего внутреннего диаметра, что может привести к корректированию
для минимизации расширения полосы вне колонки за счет таких факторов, как соединения
прибора, объем ячейки детектора, и скорость отбора проб, а также вводимый объем пробы. При
изменении размера частиц необходимо корректировать скорость подвижной фазы, так как для
колонок с меньшим размером частиц требуется более высокая линейная скорость для
достижения такой же производительности (измеряемой по уменьшенной высоте пластины).
Скорость подвижной фазы регулируют с учетом изменения диаметра колонки и размера частиц
с помощью следующего уравнения:
где:
F
1
‒ скорость подвижной фазы, указанная в частной монографии, в миллилитрах в
минуту;
F
2
‒ скорректированная скорость подвижной фазы, в миллилитрах в минуту;
dc
1
‒ внутренний диаметр колонки, указанный в частной монографии, в миллиметрах;
dc
2
‒ внутренний диаметр используемой колонки, в миллиметрах;
dp
1
‒ размер частиц, указанный в частной монографии, в микрометрах;
dp
2
‒ размер частиц используемой колонки, в микрометрах.
При изократическом элюировании изменение размера частиц с ≥ 3 мкм на частицы < 3 мкм,
дополнительное увеличение линейной скорости (путем изменения скорости подвижной фазы)
может быть допустимо при условии, что производительность колонки не снизится более чем на
20 %. Аналогично, при переходе от частиц размером < 3 мкм к частицам размером ≥ 3 мкм
дополнительное снижение линейной скорости (расхода подвижной фазы) может быть
допустимо, для избежания снижения производительности колонки более чем на 20 %. При
изменении размеров колонки допускается дополнительное изменение скорости подвижной
фазы на 50 %.
Температура колонки: ± 10 °C в случае контролируемой рабочей температуры, при отсутствии
других указаний.
В соответствии с разделами «Пригодность системы» и «Корректирование условий
хроматографирования» данной монографии могут быть изменены условия аналитической
методики (подвижная фаза, температура, pH и т.д.) в пределах допустимых диапазонов.
Подвижная фаза
Состав: содержание компонентов растворителя, присутствующего в меньшем количестве,
может корректироваться в пределах ± 30 % (относительное содержание; см. пример в разделе
«Тонкослойная хроматография»); абсолютное содержание других компонентов не может быть
изменено более чем на 10 %. Для меньшего по содержанию компонента составляет менее
(100/n) %, где n является общим количеством компонентов подвижной фазы.
рН водного компонента подвижной фазы: ± 0.2 рН, при отсутствии других указаний.
Концентрация солей в буферном компоненте подвижной фазы: ± 10 %.
Скорость подвижной фазы: при отсутствии изменения размеров колонки допускается
корректирование на ± 50 %.
Длина волны детектора: корректирование не допускается.
Объем вводимой пробы: при изменении размеров колонки объем вводимой пробы может
корректироваться по формуле:
где:
V
inj1
‒ объем вводимой пробы, указанный в частной монографии, в микролитрах;
V
inj2
‒ скорректированный объем вводимой пробы, в микролитрах;
L
1
‒ длина колонки, указанная в частной монографии, в миллиметрах;
L
2
‒ длина новой колонки, в миллиметрах;
dc
1
2
‒ внутренний диаметр колонки, указанный в частной монографии, в миллиметрах;
dc
2
2
‒ внутренний диаметр новой колонки, в миллиметрах.
Данная формула не применимо при замене колонки с полностью пористыми частицами на
колонки с поверхностно-пористыми частицами. При отсутствии изменений размеров колонки
объем вводимый пробы может корректироваться при условии, что критерии пригодности
системы находятся в установленных пределах приемлемости. При уменьшении объема
вводимый пробы следует обратить внимание (пределу) обнаружения и повторяемости
определяемого(ых) пика(ов). Увеличение объема вводимой пробы допускается при условии,
что, в частности, линейность и разрешение определяемого(ых) пика(ов) остаются
удовлетворительными.
ЖИДКОСТНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ: ГРАДИЕНТНОЕ ЭЛЮИРОВАНИЕ
Регулирование условий хроматографирования при градиентном элюировании требует большей
осторожности, чем при изократическом элюировании.
Параметры колонки и скорость подвижной фазы
Неподвижная фаза: не допускается изменение заместителей (например, не допускается замена
C18 на C8); другие физико-химические характеристики неподвижной фазы (т.е.
хроматографическая основа, модификация поверхности и степень химической модификации)
должны быть одинаковыми; допускается замена колонок с полностью пористыми частицами на
колонки с поверхностно-пористыми частицами при соблюдении условий вышеуказанных
требований.
Размеры колонки (размер частиц, длина): размер частиц и/или длина колонки могут быть
изменены при условии, что отношение длины колонки (L) к размеру частиц (dp) остается
постоянным или находится в диапазоне от – 25 % до + 50 % от указанного соотношения L/dp.
Для изменения размера частиц, т.е. полностью пористые на поверхностно-пористые, могут
быть использованы другие комбинации L и dp при условии, что отношение ( t/ wh)
2
находится
в в пределах от – 25 % до + 50 % относительно указанной колонки для каждого пика,
используемого для проверки пригодности системы, как указано в данном разделе и частной
монографии. Данные изменения допускаются при выполнении требований пригодности
системы и при подтверждении селективности и эквивалентности порядка элюирования
контролируемых примесей.
Размеры колонки (внутренний диаметр): внутренний диаметр колонки может корректироваться
при отсутствии изменения размера частиц и/или длины колонки.
Необходимо соблюдать осторожность, если в результате корректировки уменьшается объем
пика из-за меньшего размера частиц или меньшего внутреннего диаметра, что может привести
к корректированию для минимизации расширения полосы вне колонки за счет таких факторов,
как соединения прибора, объем ячейки детектора, и скорость отбора проб, а также вводимый
объем пробы.
При изменении размера частиц необходимо корректировать скорость подвижной фазы, так как
для колонок с меньшим размером частиц требуется более высокая линейная скорость для
достижения такой же производительности (измеряемой по уменьшенной высоты тарелки).
Скорость подвижной фазы регулируют с учетом изменения диаметра колонки и размера частиц
с помощью следующего уравнения:
где:
F
1
‒ скорость подвижной фазы, указанная в частной монографии, в миллилитрах в
минуту;
F
2
‒ скорректированная скорость подвижной фазы, в миллилитрах в минуту;
dc
1
‒ внутренний диаметр колонки, указанный в частной монографии, в миллиметрах;
dc
2
‒ внутренний диаметр используемой колонки, в миллиметрах;
dp
1
‒ размер частиц, указанный в частной монографии, в микрометрах;
dp
2
‒ размер частиц используемой колонки, в микрометрах.
Изменение размеров колонки и, следовательно, объема колонки влияет на объем градиента,
который контролирует селективность. Градиенты корректируются в соответствии с объемом
колонки путем изменения объема градиента пропорционально объему колонки. Данное
относится к объему каждой стадии градиента. Объем градиента представляет собой время
градиента (t
G
), умноженное на скорость потока (F), время каждой стадии градиента должно
быть скорректировано, чтобы поддерживать постоянное отношение объема градиента к объему
колонки (выраженное как L × dc
2
). Новое время градиента (t
G2
) может быть рассчитано на
основе исходного времени градиента (t
G1
), скорости подвижной фазы и размеров колонки по
формуле:
Изменение условий для градиентного элюирования включает 3 этапа:
(1) настроить длину колонки и размер частиц в соответствии с L/dp;
(2) настроить скорость подвижной фазы в зависимости от изменения размера частиц и
диаметра колонки;
(3) настроить время каждой стадии градиента с учетом изменений длины колонки, диаметра
и скорости подвижной фазы.
Приведенный ниже пример, показывает данный процесс.
Таблица 2.2.46.-2. ‒ Пример корректирования для жидкостной хроматографии –
градиентное элюирование
Параметр
Исходные
условия
Скорректированные
условия
Комментарии
Длина колонки (L), мм
150
100
Выбор
пользователя
Диаметр колонки (dс), мм
4.6
2.1
Выбор
пользователя
Размер частиц (dp), мкм
5
3
Выбор
пользователя
L/dp
30.0
33.3
(1)
Скорость подвижной фазы (F),
мл/мин
2.0
0.7
(2)
Коэффициент корректировки
градиента
0.4
(3)
Условия градиента
В (%)
Время (мин)
Время (мин)
30
0
0
30
3
(3 × 0.4) = 1.2
70
13
[1.2 + (10 × 0.4)] = 5.2
30
16
[5.2 + (3 × 0.4)] = 6.4
(1) увеличение на 11 % в пределах допустимого изменения L/dp от – 25 % до + 50 %;
(2) рассчитано с использованием F
2
= F
1
[(dc
2
2
× dp
1
)/ (dc
1
2
× dp
2
)];
(3) рассчитано с использованием t
G2
= t
G1
× (F
1
/F
2
) [(L
2
× dc
2
2
) / (L
1
× dc
1
2
)].
Температура колонки: ± 5 %, в случае контролируемой рабочей температуры при отсутствии
других указаний.
В соответствии с разделами «Пригодность системы» и «Корректирование условий
хроматографирования» данной монографии могут быть изменены условия аналитической
методики (подвижная фаза, температура, рН и т.д.) в пределах допустимых диапазонов.
Подвижная фаза
Состав/градиент: изменения состава подвижной фазы и программы градиента являются
приемлемыми при условиях, если:
– выполняются требования пригодности системы;
– основной(ые) пик(и) элюирует(ются) в пределах ± 15 % от указанного(ых) времени(ен)
удерживания, полученного(ых) в исходных условиях; требование не применяется при
изменении размеров колонки;
– состав подвижной фазы и градиент выбраны таким образом, что первые пики в достаточной
степени удерживаются, последние пики элюируются.
рН водного компонента подвижной фазы: ± 0.2 рН, при отсутствии других указаний в частной
монографии.
Концентрация солей в буферном компоненте подвижной фазы: ± 10 %.
Если соответствие требованиям пригодности системы не может быть достигнуто,
предпочтительным зачастую является оценка объема задержки или замена хроматографической
колонки.
Объем задержки
Конфигурация используемого оборудования может значительно изменить разрешение, время
удерживания и относительное удерживание, описанные в методике, что может произойти из-за
избыточного объема задержки. В частных монографиях обычно включают изократическую
стадию до начала программы градиентаного элюирования, обеспечивая адаптацию к
временным точкам градиента с учетом разницы в объеме задержки между системой,
использованной при разработке частной монографии, и фактически используемой системы.
Адаптация продолжительности изократической стадии в зависимости от используемого
аналитического оборудования входит в ответственность пользователя. Если в частной
монографии приведен объем задержки, установленный при ее разработке, то временные точки
(t) в минутах, указанные в таблице градиента, могут быть заменены на адаптированные
временные точки (t
c
) в минутах, рассчитанные по формуле:
где:
D ‒ объем задержки, в миллилитрах;
D
0
‒ объем задержки, использованный при разработке методики, в миллилитрах;
F ‒ скорость подвижной фазы, в миллилитрах в минуту.
Изократическая стадия, введенная с данной целью, может быть исключена при наличии
данных по валидации методики, применяемой без указанной стадии.
Длина волны детектора: корректирование не допускается.
Объем вводимой пробы: при изменении размеров колонки объем вводимой пробы может
корректироваться по формуле:
где:
V
inj1
‒ объем вводимой пробы, указанный в частной монографии, в микролитрах;
V
inj2
‒ скорректированный объем вводимой пробы, в микролитрах;
L
1
‒ длина колонки, указанная в частной монографии, в миллиметрах;
L
2
‒ длина новой колонки, в миллиметрах;
dc
1
2
‒ внутренний диаметр колонки, указанный в частной монографии, в миллиметрах;
dc
2
2
‒ внутренний диаметр новой колонки, в миллиметрах.
Данная формула не применимо при замене колонки с полностью пористыми частицами на
колонки с поверхностно-пористыми частицами. При отсутствии изменений размеров колонки
объем вводимый пробы может корректироваться при условии, что критерии пригодности
системы находятся в установленных пределах приемлемости. При уменьшении объема
вводимый пробы следует обратить внимание (пределу) обнаружения и повторяемости
определяемого(ых) пика(ов). Увеличение объема вводимой пробы допускается при условии,
что, в частности, линейность и разрешение определяемого(ых) пика(ов) остаются
удовлетворительными.
ГАЗОВАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ
Параметры колонки
Неподвижная фаза:
‒ размер частиц: допускается максимальное уменьшение размера на 50 %; увеличение не
допускается (набивные колонки);
‒ толщина пленки: от – 50 % до + 100 % (капиллярные колонки).
Размеры колонки:
‒ длина: от – 70 % до + 100 %;
‒ внутренний диаметр: ± 50 %.
Температура колонки: ± 10 %.
Температурная программа: допускается корректирование температуры, как указано выше;
допускается корректирование скорости линейного изменения температуры и мертвое время на
± 20 %.
Скорость потока: ± 50 %.
Вышеуказанные изменения допускаются при выполнении требований пригодности системы и
при подтверждении селективности и эквивалентности порядка элюирования контролируемых
примесей.
Объем вводимой пробы и коэффициент деления: могут быть изменены при подтверждении
соответствия критерий пригодности системы установленным пределам приемлемости. При
уменьшении объема вводимой пробы или увеличение коэффициента деления, следует обратить
внимание (пределу) обнаружения и повторяемости определяемого(ых) пика(ов). Допускается
увеличение объема вводимой пробы или уменьшение коэффициента деления при условии, что,
в частности, линейность и разрешение определяемого(ых) пика(ов) остаются
удовлетворительными.
Температура блока ввода проб и температура линии передачи в условиях статической
парофазной системы: ± 10 С при условии отсутствия разложения или конденсации.
КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ
В общих текстах или монографиях могут использоваться следующие подходы к
количественному определению.
Метод внешнего стандарта
Использование калибровочной функции. Готовят растворы сравнения, как указано в частной
монографии, с различными количествами стандартного образца испытуемого вещества в
диапазоне, который дает линейный отклик и вводят фиксированный объем данных растворов
сравнения. На основании полученных хроматограмм строят калибровочную кривую в
зависимости площади пиков или высоты пиков по оси ординат от количества стандартного
образца по оси абсцисс. Калибровочную функцию получают линейной регрессией. Раствор
испытуемого вещества готовят в соответствии с методикой, указанной в частной монографии.
Хроматографируют в тех же условиях, что и при подготовке калибровочной функции.
Измеряют площадь или высоту пика испытуемого вещества, а количество вещества
рассчитывается на основе калибровочной функции.
Использование калибровки по одной точке. В частной монографии обычно готовят один из
растворов сравнения с концентрацией в линейном диапазоне калибровочной функции и раствор
испытуемого вещества с концентрацией, близкой к концентрации раствору сравнения.
Хроматографуруют в установленных условиях для определения количества испытуемого
вещества путем сравнения полученных откликов. В данном методе все действия, такие как ввод
проб, должны выполняться при соблюдении установленных условий.
Метод внутреннего стандарта
Использование калибровочной функции. В методе внутреннего стандарта в качестве
внутреннего стандарта выбирается стабильное вещество, которое показывает время
удерживания, близкое к времени удерживания испытуемого вещества, и пик которого на
хроматограмме хорошо отделен от всех других пиков. Готовят несколько растворов сравнения,
содержащих установленное количество внутреннего стандарта и определенные количества
стандартного образца испытуемого вещества. На основе хроматограмм, полученных при
введении установленного объема отдельных растворов сравнения, рассчитывают отношение
площади или высоты пика стандартного образца к внутреннему стандарту. Строят
калибровочную кривую откладывая по оси ординат данные соотношения против количества
стандартного образца (или отношение количества стандартного образца к количеству
внутреннего стандарта) по оси абсцисс. Калибровочную функцию получают линейной
регрессией. Раствор испытуемого вещества готовят с таким же количеством внутреннего
стандарта, как и в растворах сравнения, использованных для приготовления калибровочной
функции в соответствии методикой, указанной в частной монографии. Хроматографируют в тех
же условиях, что и при подготовке калибровочной функции. Рассчитывают отношение площади
или высоты пика испытуемого вещества к площади пика внутреннего стандарта, а количество
вещества рассчитывается на основе калибровочной функции.
Использование калибровки по одной точке. В частной монографии, готовят один из растворов
сравнения с концентрацией в линейном диапазоне калибровочной функции и испытуемый
раствор с концентрацией, близкой к концентрации раствору сравнения (оба раствора содержат
установленное количество внутреннего стандарта). Хроматографируют в установленных
условиях для определения количества испытуемого вещества путем сравнения полученных
соотношений.
Метод внутренней нормализации
При подтверждении линейности пиков в частных монографиях может быть указано, что
содержание компонента испытуемого вещества в процентах рассчитывается путем определения
площади соответствующего пика как части, выраженной в процентах от общей площади всех
пиков, за исключением пиков растворителей или реактивов, или пиков, обусловленных
компонентами подвижной фазы или матрицы испытуемого образца, а также пиков веществ, с
площадью, равной или меньшей порога информирования.
ДРУГИЕ УСЛОВИЯ
Отклик детектора
Чувствительность детектора представляет собой сигнал на выходе на единицу концентрации
или единицу массы вещества в подвижной фазе, входящей в детектор. Относительный
коэффициент отклика детектора, называемый обычно коэффициентом чувствительности,
выражает чувствительность детектора к данному веществу относительно стандартного
вещества. Поправочный коэффициент обратно пропорционален коэффициенту
чувствительности. В испытаниях на родственные примеси применяют поправочные
коэффициенты, приведенные в частной монографии (т. е. когда коэффициент чувствительности
выходит за пределы от 0.8 до 1.2).
Промежуточные пики
Не учитывают пики растворителей и реактивов, а также пики подвижной фазы и матрицы
испытуемого образца.
Измерение пиков
Интегрирование площади пика любой примеси, которая не полностью разделяется с основным
пиком, обычно выполняется по касательной (рисунок 2.2.46.-9).
Рисунок 2.2.46.-9.
Порог информирования
Если испытание на родственные примеси регламентирует нормы для суммы примесей или для
количественного определения одной примеси, важно выбрать соответствующий порог
информирования и подходящие условия для интегрирования площадей пиков. В таких
испытаниях порог информирования (т.е. предел, выше которого требуется информирование о
присутствии примеси) обычно составляет 0.05 %.
